microRNA检测

MicroRNA (miRNA)是一类广泛存在于真核生物当中的长度为 18~25 个核苷酸的小分子 RNA, 由 pre-miRNA(precursor microRNA) 剪切而来, 广泛存在于各种真核生物中。参与了多种生理和病理过程，其表达水平与疾病，尤其是癌症的发生和发展密切相关，因此，miRNA的检测对于生物学的基础研究以及疾病的分子诊断和治疗具有重要意义。

为了验证miRNA在组织细胞内的表达，目前常用来检测miRNA的技术主要有以下几种：Northern杂交，原位杂交，Stem-loop实时定量RT-PCR。这三种技术各有利弊，可以相互结合应用，来反映细胞内miRNA的真实表达水平。

目前最为广泛使用的是Stem-loop实时定量RT-PCR方法，但是引物设计复杂，灵敏度不足。我们在Stem-loop引物的基础上进行了改进，使用RCA进行扩增，显著提高了灵敏度，是现有检测方法的100-1000倍，这对认识miRNA的功能具有重要意义。

在获得miRNA的信息后，靶基因的鉴定显得尤为重要。初步可以通过计算机/软件预测miRNA的靶基因，但是存在一定的局限性，利用生物学实验方法可以更加直观地寻找miRNA靶基因。目前主要是从mRNA水平与蛋白质水平来寻找靶基因。从mRNA水平来寻找靶基因主要是通过在细胞内过表达miRNA后，利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA的靶基因。这种方法由于miRNA所介导的转录后翻译抑制过程不引起mRNA水平的改变，因此依据mRNA水平的变化寻找miRNA靶基因的方法在检出率上存在一定问题。故采用蛋白质质谱的方法可以有效弥补这个不足。同时再结合miRNA靶基因的预测方法，可以大大提高了靶基因的检出率及可靠性。目前鉴定靶基因最直接的方法是, 利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化, 从而确定miRNA与靶基因的对应关系。 这种方法可以大大提高准确率，但最终确定靶基因，还需要鉴定miRNA的靶位点。而miRNA的靶位点的鉴定最常用的方法是荧光素酶报告基因法。

我们发展了miRNA的多种检测方法且做了应用，包括测序、芯片、qPCR、RCA和免疫学等方法，共同促进研究的效率，并可为临床应用提供帮助。